Определение аминокислот и пептидов, метод ВЭЖХ

Методы, используемые для аминокислотного анализа, обычно основаны на хроматографическом разделении в таких вариантах как обращеннофазовая, нормально-фазовая, гель-фильтрационная, аффинная, иммунная. В мировой практике для исследования пептидов и белков наиболее распространен метод ВЭЖХ в сочетании с масс-спектрометрическим, преимущественно тандемным (ВЭЖХ-МС/МС), детектированием.

Анализ литературных данных показывает, что метод высокоэффективной жидкостной хроматографии обеспечивает лучшее разделение аналитов, чем газовая хроматография, и позволяет достичь более низких пределов определения по сравнению с тонкослойной хроматографией.

Для разделения компонентов смесей пептидной и белковой природы чаще остальных используются обращенные фазы с использованием силикагеля с привитыми алкильными группами C8 и C18. со средними размерами пор 300 Å. Элюирование веществ пептидной или белковой структуры или их фрагментов, полученных в результате ферментативного расщепления, в ОФ ВЭЖХ, в основном проводится в режиме градиентного элюирования при pH=2-3 при комнатной температуре, поскольку при повышении температуры возможна частичная или полная денатурация белка, что также влияет на хроматографическую подвижность.

Аминокислотный анализ – это двухэтапная процедура количественного определения молекул аминокислот в белках и пептидах:

первый шаг включает расщепление белка или полипептида на свободные аминокислоты;

— второй шаг включает отделение свободных аминокислот друг от друга и их последующее обнаружение.

Отсутствие хромофорных групп в большинстве молекул аминокислот требует стадии дериватизации. Для пред- и постколоночной дериватизации предложены различные реагенты. Метод обращенно-фазовой ВЭЖХ включающее предколоночную дериватизацию используется чаще, поскольку они быстрее, более чувствительны и менее дорогостоящие для анализа аминокислот.

Наиболее часто используемыми реагентами в предколоночной дериватизации являются: фенилизотиоцианат (ФИТЦ), что дает производные, обнаруживаемые с помощью УФ детектора и офталдиалдегид (ОФА), диметиламинонафталин сульфонилхлорид (Дансил-Cl) и 9-флуоренилметил-хлорформиат (ФМХ) которые дают флуоресцентные производные.

Использование диэтилэтоксиметиленмалоната (ДЭММ) при предколоночной дериватизации дает производные аминокислот обнаруживаемые с помощью диодноматричного детектора (УФ и видимый диапазон).

Пробоподготовка реальных объектов (мяса, комбикормов, кислотных экстрактов предстательной и поджелудочной желёз и т.д.) включает в себя кислотный гидролиз проб и модификацию аминокислот раствором фенилизотиоцианата или других дериватизиционных реагентов.

Также особенно важно правильно подобрать материалы и реагенты для эксперимента (колонки, неподвижную и подвижную фазы).

Подбор колонки для хроматографирования осуществляется исходя из следующих характеристик:

—  природа частиц;

— чистота силикагеля;

— диаметр пор;

— гидрофобная поверхность;

— разделительная поверхность;

— пептидная селективность;

— длина колонки (длина колонки не важна при разделении белков, и короткие колонки разделяют белки так же, как длинные, а для разделения пептидов рекомендуются колонки размером пятнадцать или двадцать пять сантиметров);

— диаметр колонки.

 

В нашем ассортименте вы найдете нужную для вас колонку от ведущих производителей Merck, YMC и Chromservis высочайшего качества, а наши специалисты помогут в выборе подходящей колонки по всем параметрам. Данные колонки прекрасно подходят для определения аминокислот, пептидов и белков.

В таблице ниже представлена продукция по колонкам для ВЭЖХ от производителя Merck:

 

НаименованиеРазмер частиц
[µm]

Размер пор
[nm / Å]

рН
SUPELCOSIL™ LC-18 HPLC Column51202.0-7.5
SUPELCOSIL™ LC-NH2 HPLC Column5120-
LiChrospher® RP-18 HPLC Column5100-
Chromolith® Performance RP-18 endcapped 100-4.6 HPLC column0.013, 21002.0-7.5
LiChrospher® 100 RP-18 LiChroCART® 250-451002.0-7.5

 

Далее можно ознакомиться с ассортиментом колонок от производителя YMC:

 

НаименованиеРазмер частиц
[µm]

Размер пор
[nm / Å]

рН
YMC-Triart C181.9, 3, 512 / 1201.0-12.0
YMC-Triart C18 ExRS1.9, 3, 58 / 801.0-12.0
YMC-Triart Bio C181.9, 3, 530 / 3001.0-12.0
YMC-Pack Pro C182, 3, 512 / 1202.0-8.0
YMC-Pack Pro C18 RS3, 58 / 801.0-10.0
Meteoric Core C182.78 / 801.5-10.0
YMC-Pack ODS-A3, 512, 20, 30 /
120, 200, 300
2.0-7.5
YMC-Pack ODS-AM3, 512 / 1202.0-7.5
J'Sphere ODS-H8048 / 801.0-9.0

 

В следующей таблице находятся позиции от производителя Сhromservis:

 

НаименованиеРазмер частиц
[µm]
Размер пор
[nm / Å]

рН
ARION® C8 HPLC column3, 51202.0-7.0
ARION® Plus C18 HPLC column3, 51001.0-10
ARION® Polar C18 HPLC column3, 51201.5-7.0
ARION® HILIC Plus HPLC column3, 51001.5-7.0
ARION® NH2 HPLC column3, 51202.0-6.5
ARION® Phenyl-Butyl HPLC column3, 51001.5-7.0

 

Также наши химики помогут подобрать колонку нужную по длине и диаметру. Помимо качественных колонок для ВЭЖХ, у нас вы сможете приобрести вспомогательные материалы и систему предколонок для надежной защиты. Данную систему можно использовать практически со всеми ВЭЖХ колонками на рынке.

 

Выбор мобильной фазы также является определяющим фактором для успешного проведения анализа.

Белки десорбируются с гидрофобной поверхности с помощью органического растворителя. Наиболее часто используемым в хроматографии для определения пептидов с обращенной фазой является ацетонитрил. Ацетонитрил используется, потому что он:

летучий и легко удаляется из образца;

— имеет низкую вязкость и, следовательно, низкое противодавление;

— достаточно прозрачен для ультрафиолетового излучения с низкой длиной волны;

— имеет долгую историю успешного разделения.

Изопропанол также играет особую роль в хроматографии полипептидов. Хотя он редко используется в качестве единственного органического модификатора из-за его высокой вязкости (и, как следствие, высокого противодавления), он полезен для улучшения извлечения некоторых полипептидов, особенно очень гидрофобных белков. В таких случаях изопропанол добавляют в постоянной концентрации 1-5% для увеличения выделения или элюирования гидрофобных полипептидов.

Другие органические модификаторы. Органические модификаторы, такие как метанол или этанол, используются редко, за исключением очень гидрофобных белков. Этанол также используется для крупномасштабной очистки белков из-за его низкой токсичности.

Градиентное элюирование. Полипептиды почти всегда элюируются с использованием градиентного растворителя, при котором относительная концентрация органического растворителя медленно увеличивается во время разделения. Чем медленнее скорость изменения концентрации органического модификатора (крутизна градиента), тем лучше разрешение этих белковых субъединиц. Например, отлично подойдет № 100030 «Acetonitrile gradient grade for liquid chromatography» от Merck.

ProSpection также является поставщиком различных мобильных фаз для хроматографии и может предложить огромный выбор растворителей как для аминокислотного определения, так и для других видов анализа.

 

Детектирование.

 При разделении полипептидов с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ детектирование обычно осуществляется по УФ-поглощению при 214-215 нм. Пептидная связь хорошо поглощается в этом диапазоне длин волн и обеспечивает наиболее чувствительное обнаружение полипептидов всех типов.

Одной из проблем при использовании для обнаружения области с низким УФ-излучением является поглощение подвижной фазой. Ацетонитрил не поглощает УФ-свет на длине волны 215 нм, однако TФК (трифторуксусная кислота) немного поглощает в этой области. Во время градиентного элюирования возрастающая концентрация органического растворителя вызывает изменение диэлектрической проницаемости раствора, что приводит к сдвигу в спектре поглощения TФК в низком УФ-диапазоне.

Детектор испарительного рассеяния света (ELSD) потенциально полезен в тех случаях, когда обнаружение ультрафиолета (УФ) невозможно. Теория ELSD основана на различиях в летучести растворителя и образца.

ELSD работает путем распыления летучих продуктов, выходящих из колонки ВЭЖХ, в мелкодисперсный туман. Мелкое облако растворенных частиц переносится с высокой скоростью через луч света, где рассеянный свет обнаруживается фотоумножителем. Количество рассеянного света зависит от размера и количества частиц и, следовательно, пропорционально концентрации.

Метод ВЭЖХ является эффективным не только при определении аминокислот и пептидов, но и для анализа витаминов.

Согласно справочнику «The essential chromatography & spectroscopy catalog LC and LC/MS» разделить смесь витаминов группы В можно, используя буферный 0,1 М раствор ортофосфата натрия с рН=2,5 с градиентом концентрации органического растворителя от 2% до 60%. Для более корректного разделения пиков тиамина и пиридоксина при их совместном нахождении в растворе рекомендуется добавлять в буферный раствор ион-парный агент.

Вещества лидокаинового ряда также можно разделить при помощи 0,1 М буферного раствора ортофосфата натрия (№ 119753 из каталога Merck), но значение рН раствора должно быть равным 4. В этой системе лидокаина гидрохлорид обнаруживается при содержании в подвижной фазе 30–40% органического растворителя.

Бензиловый спирт (№ 822259 из каталога Merck) можно обнаружить, используя любой фосфатный буфер со значением рН=4–6. Главное условие его определения – длина волны спектофотометрического детектора в диапазоне от 240 до 250 нм.

Таким образом, представляется возможным количественное определение индивидуальных компонентов в комплексе витаминов.

 

Если у вас остались вопросы по выбору необходимого продукта, наши специалисты обязательно вас проконсультируют и помогут сделать правильный выбор.

 

Чтобы подать заявку, позвоните по тел. +420 776644290 или отправьте по электронной почте: a.calyj@prospection.cz