Витамины

Витамины имеют разнообразное химическое строение, что затрудняет их определение, однако существует множество методов для анализа витаминов:

— спектрофотометрический;

— флюорометрический;

— фотометрический;

— титриметрический;

— хроматографический (метод ВЭЖХ).

Выбор метода анализа также зависит от типа витаминов. Они делятся на водорастворимые и растворимые в жирах. К первой группе относятся: витамины В1 (тиамин), В2 (рибофлавин), В3 (пантотеновая кислота), витамин РР (никотиновая кислота, никотинамид), В6 (пиридоксин, пиридоксаль, пиридоксамин), В12 (цианокобаламин), фолиевая кислота (птероилглютаминовая кислота), биотин (витамин Н), витамин С (аскорбиновая кислота), витамин Р (биофлавоноиды). Группа жирорастворимых витаминов включает: А (ретинол), Д (кальциферолы), Е (токоферолы), К (филлохиноны) и  F  –  комплекс ненасыщенных жирных кислот, Q – убихинон.

Все водорастворимые витамины (за исключением витамина С в некоторых случаях) определяют методом ВЭЖХ. Это оптимальный и эффективный метод. Остальными методами можно определить 2–3 компонента, но для полного анализа всего состава основных действующих веществ эти методы не могут быть применимы.

Процесс определения водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ состоит из следующих этапов:

 

  1. Приготовление подвижной фазы
  2. Приготовление стандартного раствора
  3. Приготовление испытуемого раствора
  4. Проведение анализа

 

Рассмотрим подробнее на примере анализа витаминов группы В (В1, В2, В3, В6, ВС и др.):

Приготовление подвижной фазы. Для получения подвижной фазы смешивают растворы А и B в нужном соотношении.

Раствор А. Берут точную навеску пентансульфоната натрия (№P0299 из каталога Sigma-Aldrich) и ледяную уксусную кислоту (№33209 из каталога Sigma-Aldrich), все растворяют в смеси метанол (№34860 из каталога Sigma-Aldrich) – вода (25:75), переносят в мерную колбу, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают.

Раствор B готовят также, за исключением отличия в навеске пентасульфоната натрия.

Приготовление стандартного раствора. В зависимости от состава анализируемого препарата готовят стандартный раствор витаминов рассматриваемой группы, содержащихся в этом препарате. Стандартные образцы различных витаминов можно приобрести у нас от ведущих производителей. Например, некоторые позиции от Мerck и Sigma-Aldrich представлены в таблице ниже:

 

Номер продуктаНазвание продуктаРазмер упаковки
47858Thiamine Hydrochloride (B1), analytical standard1000 мг
47861Riboflavin (B2), analytical standard1000 мг
47869Cyanocobalamin (B12), analytical standard100 мг
C3000000Cyanocobalamin, European Pharmacopoeia (EP) Reference Standard-
47862Pyridoxine Hydrochloride (B6), analytical standard1000 мг
47866Folic acid, analytical standard500 мг
F0300000Folic acid, European Pharmacopoeia (EP) Reference Standard-
N0600000Nicotinamide, European Pharmacopoeia (EP) Reference Standard-

 

Точные навески стандартных образцов витаминов В1, В2, В6, никотинамида, Вс (фолиевой кислоты), и т.д. примерно равные содержанию этих витаминов в 1 таблетке (капсуле, дозе) анализируемого препарата, помещают в мерную колбу, добавляют подвижную фазу, нагревают на водяной бане при 60 °С, охлаждают до комнатной температуры, доводят объем раствора подвижной фазой до метки и перемешивают.

Приготовление испытуемого раствора. Растирают 10 таблеток (содержимое 10 капсул) и отбирают точную навеску порошка, примерно равную массе одной таблетки или содержимого одной капсулы. При анализе жидких или гелеобразных образцов берут точную навеску, примерно равную массе одной дозы препарата. навеску помещают в мерную колбу. Далее поступают, как при приготовлении стандартного раствора. При необходимости используют другое разведение для получения приемлемых для конкретных условий анализа концентраций витаминов.

Проведение анализа. Последовательно хроматографируют предварительно отфильтрованные через фильтр с размером пор 0,5 мкм стандартный и испытуемый растворы, проводя УФ-детектирование при 280 нм.

 

Для хроматографирования подходит колонка длиной от 100 до 250 мм, внутренним диаметром от 4,0 до 4,6 мм, заполненная сорбентом размером частиц 5 мкм. Например, отлично подойдут следующие колонки из нашего ассортимента:

 

Номер продуктаНазвание продуктаПроизводитель
152270Chromolith® WP 300 RP-18 100-4.6 HPLC columnMerck
152260Chromolith® WP 300 RP-4 100-4.6 HPLC columnMerck
151465Chromolith® Performance Si 100-4.6 HPLC columnMerck
152022Chromolith® HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 HPLC columnMerck
151468Chromolith® Performance RP-8 endcapped 100-4.6 HPLC columnMerck
150182Hibar® 250-4Merck
151431LiChroCART® 250-4.6Merck
151432LiChroCART® 150-4,6Merck
150174LiChroCART® 250-4Merck

 

Рекомендуется использовать для анализа следующие марки сорбентов на основе силикагеля Lichrosorb Si-60, Spherosorb Si, Hypersil Si и Lichrospher 100 Diol. Пригодны для проведения анализа следующие марки обращенно-фазовых сорбентов: Liuchrospher Si 60 RP Select, Spherisorb ODS, Bondapak radial C18, Supelco LC-18-DB и Hypersil ODS.

Данные сорбенты и не только вы можете приобрести у нас, а наши специалисты обязательно проконсультирует по всем вопросам и помогут сделать правильный выбор.

 

Метод ВЭЖХ подходит для анализа не только водорастворимых, но и жирорастворимых витаминов. Сущность метода остается прежней: образцы проб пропускают через жидкостной хроматограф в ультрафиолетовой области спектра с заданной длиной волны. Полученные результаты в виде пиков на хроматограмме сопоставляют с пиками стандартных растворов образцов витаминов известных массовых концентраций. Отличие лишь в отборе и подготовке проб. Для жирорастворимых витаминов требуется щелочной гидролиз пробы продукта и экстракция самих витаминов диэтиловым эфиром.

 

Процесс определения жирорастворимых витаминов методом ВЭЖХ:

 

  1. Отбор проб
  2.  Приготовление растворов витаминов (стандартные образцы)
  3. Приготовление градуировочных растворов витаминов
  4. Подготовка пробы
  5. Щелочной гидролиз пробы
  6. Экстракция жирорастворимых витаминов
  7. Проведение анализа

 

Условия проведения хроматографического анализа подбираются в зависимости от вида применяемого жидкостного хроматографа и хроматографической колонки. В качестве примера могут быть приведены следующие условия хроматографического определения жирорастворимых витаминов, выполненные на жидкостном хроматографе:

— хроматографической колонкой для ВЭЖХ длиной 50-150 мм и диаметром 2,1-4,6 мм с обращенной фазой размером частиц 1,8-5,0 мкм, имеющей эффективность не менее 5000 теоретических тарелок по пикам витаминов;

— для разделения витаминов D2 и D3 рекомендуется использовать хроматографические колонки с обращенной фазой типа РАН (пористые силикагельные частицы, химически модифицированные фенильными группами, размер пор 95 А, эффективная поверхность 160 м/г, углерод 14%).

 

Для подготовки проб необходимы:

— спирт этиловый (№ 493511 из каталога Sigma-Aldrich);

— эфир диэтиловый, ч.д.а. (№ 91238 из каталога Sigma-Aldrich);

— метанол, ос.ч. (№ 322415 из каталога Sigma-Aldrich);

— калия гидроокись, х.ч. (№ 1.05033 из каталога Sigma-Aldrich);

— натрий сернокислый безводный. (№ 1614807 из каталога Sigma-Aldrich).

 

Стандартные образцы витаминов:

 

Номер продуктаНазвание продуктаРазмер упаковки
C0166000Calcifediol, European Pharmacopoeia (EP) Reference Standard-
47782D-α-Tocopherol succinate, analytical standard100 мг
T1550000α-Tocopherol, European Pharmacopoeia (EP) Reference Standard-
47783(±)-α-Tocopherol, analytical standard100 мг
R0300000Retinol acetate, European Pharmacopoeia (EP) Reference Standard-
47763Cholecalciferol (D3), analytical standard100 мг
PHR1238Ergocalciferol (Vitamin D2), Pharmaceutical Secondary Standard100 мг

 

Состав элюента: смесь метанола и воды в объемном соотношении 92:8. Скорость подачи элюента 2,0 см/мин.

 

Детектирование проводят при следующих длинах волн:

 

325 нм — для витамина А;

270 нм — для витаминов D2 и D3 ;

285 нм — для витамина E.

 

Идентификацию пиков хроматограммы исследуемого раствора проводят сравнением с хроматограммой градуировочного раствора по двум параметрам: времени удерживания и спектральному отношению (отношение высот хроматографического пика на разных длинах волн).

 

Таким образом, ProSpection может предложить все необходимые реагенты, стандартные образцы, колонки, сорбенты и др. для проведения качественных и достоверных анализов. Если у вас остались вопросы, наши химики доступны для консультаций по подбору необходимых продуктов.

Чтобы подать заявку, позвоните по тел. +420 776644290 или отправьте по электронной почте: a.calyj@prospection.cz